Le prime tracce di insediamenti umani nella zona di Città della Pieve risalgono al Neolitico (circa 6000-2000 a.C.), come dimostrano alcuni reperti ritrovati in vari punti del territorio circostante, che includono strumenti in pietra e frammenti ceramici. L'area, situata tra Val di Chiana e Val d'Orcia, era infatti un importante crocevia di popoli e culture.
Durante l'Età del Bronzo (circa 2000-1000 a.C.), la regione iniziò a essere più intensamente abitata, con l'emergere di piccoli villaggi che si insediavano nelle zone collinari. Questi villaggi preistorici erano caratterizzati da abitazioni costruite con materiali naturali come legno e pietra, e la produzione di utensili in bronzo e ceramiche decorative.
Nel corso dell'Età del Ferro (circa 1000-500 a.C.), l'area vide una maggiore organizzazione sociale, probabilmente influenzata dalla crescente presenza dei popoli etruschi, che si stabilirono nel territorio circostante.
Sebbene Città della Pieve non fosse una delle principali città etrusche, la sua posizione strategica su un colle che dominava le valli circostanti ne fece un importante punto di transito per i commerci e le comunicazioni. La zona, infatti, si trovava lungo le principali rotte etrusche che collegavano le città di Chiusi, Cortona e Perugia, facilitando così il flusso di beni e informazioni tra i centri della civiltà etrusca.
La presenza etrusca nella regione è testimoniata da alcuni resti di tombe e oggetti funerari rinvenuti nelle vicinanze di Città della Pieve. Le necropoli etrusche, luoghi di grande importanza religiosa e sociale, erano destinate a sepolture di membri della classe dirigente ma anche di persone comuni. Le tombe, spesso scavate nella roccia o costruite a forma di tumulo, riflettevano la profonda connessione tra la vita e l'aldilà che caratterizzava la cultura etrusca. Questi luoghi sacri erano solitamente situati in posizioni panoramiche o strategiche, simboleggiando il passaggio dal mondo terreno alla dimensione divina.
Alcuni studi suggeriscono che le necropoli nei dintorni di Città della Pieve fossero strettamente legate alla città di Chiusi, una delle più influenti dell'antica civiltà etrusca, che esercitava un ampio dominio sulla zona. Tra i reperti rinvenuti nelle tombe, si annoverano vasi decorati, armature, gioielli e statuette votive, testimonianze di una cultura che attribuiva un grande valore alla preparazione dei defunti per il viaggio nell'aldilà e alla perpetuazione della memoria degli antenati.
Con l'espansione dell'Impero Romano nel III secolo a.C., la regione che oggi ospita Città della Pieve divenne parte integrante della rete di colonie e municipi sotto il controllo di Roma. Sebbene la città di Città della Pieve non abbia avuto un'importanza strategica o amministrativa come altri centri romani più sviluppati nella zona, la sua posizione favorevole continuò a farne un nodo cruciale nelle rotte commerciali e di comunicazione.
Durante il periodo romano, l'area che circonda Città della Pieve continuò a essere abitata e sfruttata per l'agricoltura, soprattutto grazie alla sua fertile valle. Gli Etruschi avevano già iniziato a rendere la regione una zona ricca e prospera, e con l'arrivo dei Romani, le tecniche agricole e le infrastrutture furono migliorate e ampliate. L'uso delle terre per la coltivazione di grano, olivo e viti divenne una pratica sempre più consolidata, contribuendo al benessere della zona.
Uno degli aspetti più significativi dell'influenza romana su Città della Pieve fu lo sviluppo delle vie di comunicazione. I Romani erano maestri nella costruzione di strade e ponti, e la zona venne probabilmente inclusa in una rete stradale che collegava importanti città etrusche come Chiusi e Cortona a Roma e ad altri centri dell'Italia centrale. Queste strade facilitarono il commercio, ma anche i movimenti militari, aumentando l'integrazione della regione nell'Impero.
Durante il periodo imperiale, l'architettura romana si fece strada anche in questi territori, con la costruzione di ville rurali e villaggi che testimoniano il modello di vita romano nelle campagne. Molti di questi insediamenti erano dedicati alla produzione agricola su larga scala, un aspetto che rimase fondamentale anche dopo la fine del dominio romano.
Un altro elemento che si affermò in epoca romana fu la diffusione della religione romana. Sebbene la religione etrusca non scomparve immediatamente, la presenza di templi e luoghi di culto romani nella regione iniziò a diventare sempre più evidente. Le divinità romane si affiancarono a quelle locali, e la religione divenne uno degli strumenti di romanizzazione della popolazione. La fondazione di templi dedicati a divinità come Giove, Minerva e Diana rifletteva il forte legame tra il potere politico e religioso di Roma e le terre conquistate.
La fine della civiltà etrusca e l'assimilazione di questa zona nell'Impero Romano segnarono un'importante transizione. I Romani, pur mantenendo molte delle tradizioni etrusche, importarono anche nuove tecniche architettoniche, artistiche e culturali che modificarono gradualmente l'identità della regione. Città della Pieve, pur non diventando una grande città romana, divenne comunque una parte integrante di un più vasto territorio amministrato dalla potenza di Roma.
Con l'affermarsi del Cristianesimo nel IV e V secolo d.C., e l'inizio del declino dell'Impero Romano d'Occidente, la zona iniziò a vedere nuovi sviluppi legati alla nascita di insediamenti cristiani. La trasformazione della Pieve di Santa Maria, che con il tempo divenne il centro spirituale della città, è solo uno degli esempi di come la religione e le tradizioni cristiane iniziarono a sostituire progressivamente le pratiche religiose romane e pagane.